挖掘微生物：为抗争疾病创造基因组工具

成千上万不同的细菌种类构成了人类的肠道植物群

● 随着DNA测序成本越来越低，基因组学已经成为研究个体微生物及微生物群落的流行工具。如今，各式各样的测序技术已整装待发，从样本采集至分析等各方面来协助研究人员。

2015年，伦敦皇家布朗普敦医院重症监护室的几位患者出现了不明原因的病症。医生怀疑是真菌感染，但是难以确诊，而培养病人血液中的菌类又需要时间。于是，他们请来了伦敦帝国大学的遗传流行病学家乔•罗德斯（Jo Rhodes）。在使用了名叫MinlON的微型DNA测序机后，罗德斯确认了病原体为念珠菌，这是2009年在日本首次发现的新的真菌种类。通过与患者的序列比较，罗德斯可以判断疫情爆发始于单一源头，可能是受污染设备。她为真菌建立了一个完整的基因组，通过与美国疾病预防控制中心从世界各地收集的念珠菌序列进行对比，确定了医院菌株与来自印度或巴基斯坦的菌株相关。

尽管疫情爆发在找到准确源头前就已被控制，罗德斯认为如此迅速的测序能够提供重要的医疗信息。例如，测序能够鉴定对氟康唑有抗药性的基因，这将有助于医生避免常见但在一些情况下无用的治疗。

个体化医疗并不是这类微生物DNA阅读的唯一应用。加州大学戴维斯分校的进化微生物学家乔纳森•艾森（Jonathan Eisen）说：“低成本测序已经彻底颠覆了微生物基因组学。一个细菌或古细菌的完整基因组成本可能低于100美元。”研究人员正在收集微生物基因组以鉴定各种疾病的原因，从简单的病毒感染到复杂的疾病，如受到肠道微生物群落影响的癌症。他们正利用基因组探索新型治疗方法，包括微生物本体及其产物。研究人员同时也在研究许多其他微生物的基因组，如污染供水中的微生物基因组。

对微生物中的核糖体RNA（rRNA）基因进行测序能够帮助研究人员在属级鉴别它们。然而，许多研究人员想要额外的数据，例如，对于单个或群组样本中不同功能的基因，只有通过全面测序才能够提供。

去哪里找粪便？

研究人员开始处理数据前，他们有一个更基本的挑战——获取样本。在阿肯色州小石城的儿童研究中心，临床研究学家约翰•斯拉特里（John Slattery）和他的同事们致力于研究自闭症谱系障碍（ASD）的发病原因和生理特征。近期，他们正着重研究患者肠道中的微生物，这些微生物可能是造成ASD患者胃肠道问题和线粒体功能障碍的主要原因。斯拉特里希望对ASD患者的肠道微生物进行更深入的研究，但有一个问题，粪便样本很难获取。捐赠者必须使用一种叫“收集帽”的笨重容器。对于儿童和他们的家长来说，这是非常令人反感的。而80%患有ASD的儿童有便秘、腹泻或两种症状交替出现，这让获取粪便样本难上加难。这就是斯拉特里坚持使用科罗拉多州森特尼尔市BioCollective公司研制的BioCollector取样器材的原因。BioCollector可以方便地挂在坐便器盖上，并在使用后自动密封。“这就像一个糟糕的礼物，”斯拉特里说，“你不需要看到它。”

2015年成立的BioCollective公司，为愿意提供粪便样本的人和想要研究粪便的科学家建立了一种不寻常的合作关系。粪便捐赠者花费39.95美元购买一个BioCollector，在收集样本并寄出后，他们的肠道微生物会用rRNA基因测序进行尽可能精确的鉴定。之后，捐赠者会得到BioCollective将样本卖给研究者10%的利润。对于研究者来说，他们可以轻松、高效、低成本地获取不同的粪便样本以及捐赠者数据，例如捐赠者服用过的抗生素或他们忍耐的压力等。BioCollective公司的CEO及创始人玛莎•卡尔林（Martha Carlin）甚至希望通过几个健康样本的混合，开发一种“标准”粪便样本。

除去以上的优势，BioCollective公司可以提供特定病情或特定饮食的捐赠者样本。例如，位于威斯康星州沃瓦托撒市农业生物科学公司的生物化学家诺亚•齐默尔曼（Noah Zimmerman）希望研究多酚（蔬果中多彩及有益的成分）对肠道微生物的影响。为了帮助齐默尔曼，BioCollective公司召集了在提供样本前愿意保持高多酚饮食一个月的捐赠者。

在研究者得到样本后，他们不必自己进行样本的基因分析，有许多的研究组织愿意帮助研究者进行基因测序和分析，例如马里兰州洛克威尔市的CosmosID公司、德克萨斯州休斯顿市的Diversigen公司和加利福尼亚州南旧金山市的Second Genome Solutions公司。

对于净化过的微生物，研究者可以直接对基因组或转录组进行序列分析以鉴定基因表达模式。CosmosID公司副总经理及研发部门主管诺尔•哈桑（Nur Hasan）表示，仅仅这些简单分析就可以为研究者提供许多信息。该公司可以对客户提供的净化过的菌簇进行测序，然后进行生物信息学分析，以提供如该样本在微生物演化树中的位置、该微生物具有何种抗药性和该微生物具有何种毒力因子等信息。

Diversigen的市场销售部门经理简-菲利普•莱恩（Jean-Philippe Laine）表示，对于培养微生物用于食物或药物的公司来说，掌握所涉微生物的完整序列至关重要。

MinlON装置可以收集多个长而有持续性的数据，对于组装完整的微生物基因组格外有帮助，例如来自新型长颈鹿病原体的微生物基因组。

长颈鹿疣

尽管Diversigen公司使用的新一代测序机依然人气不减，罗德斯所使用的由牛津纳诺珀尔科技有限公司生产的MinION自2015年成为另一个选择。MinION透过薄膜上的纳米孔隙提供DNA链，同时通过这些孔隙输送电流。当腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤穿过孔隙时会对电流产生不同的改变，使得MinION可以读取相关序列。

这个比USB稍大的设备可以通过多个孔隙同时读取多重DNA链， 并且擅长收集长而有持续性的数据， 这使得MinION特别有助于组装完整的微生物基因组。

来自南非和丹麦动物园的兽医们在长颈鹿的脸上发现了奇怪的病变， 于是他们向比利时鲁汶大学的分子病毒学家发送了一些样本。 MinION在这时候派上了大用场。皮耶特•玛耶斯（Piet Maes）和他的小组愿意将更多样本投入到他们经常使用的传统的新一代测序机中，他们宁愿等待，直至等到能够提供40到160个样本。然而，玛耶斯实验室急于得到长颈鹿样本结果的博士生博尔特•范梅赫伦（Bert Vanmechelen）选择了MinION。他解释道：“MinION让我们可以在自己的电脑上测序，今天准备样本，明天就能出结果。”在如此短的时间内，范梅赫伦成功对一种新型乳头瘤病毒的基因完成测序，后被研究人员命名为“长颈鹿鹿豹座乳头瘤病毒1号”。玛耶斯说：“这种病毒链无法治愈，因此长颈鹿需手术摘除脸部病变区域。但是至少我们知道感染并不是其他更严重的情况。”

MinION同时也拥有现场能力，在非洲疫情期间用于监测埃博拉病毒的演化，甚至还被发射到国际空间站。

由微至宏

罗德斯和范梅赫伦各有单个微生物来测序，但微生物群的情况更为复杂。位于洛克威尔市Synthetic Biologic公司的研究部门副经理希拉•康奈利（Sheila Connelly）说：“微生物学家似乎从简单用rRNA基因鉴别微生物种类转变到更深度的完整基因组测序。”康奈利开始研究抗生素对猪的肠道微生物改变有何影响，这种影响和改变是否会加剧像艰难梭状芽胞杆菌这一类感染的发生，这是一个重要的医疗问题。康奈利选择了与CosmosID公司合作研究。这对合作者使用了宏基因组学方法，对康奈利所有的猪粪样本DNA进行了鸟枪法测序。测序结果提供了一份对微生物群中细菌种类及其相对数量预测的清单，以及可能整体存在于该群落中的抗生素基因清单。哈桑表示，CosmosID公司能够为其客户提供这些数据（微生物群中的细菌种类及细菌链等）都要归功于他们精心整理的标准微生物基因组数据库。从这些数据中，康奈利和她的同事不仅确定了抗生素对猪肠道细菌分布的影响,也观察到了细菌群落对抗生素的耐药性。康奈利表示，这可以解释为何抗生素头孢曲松的使用允许对多种药物似乎有抗药性的微生物接近。

这项研究帮助Synthetic Biologics公司推出了他们的主要产品之一——ribaxamase,一种可以保护健康肠道微生物免受某些静脉注射抗生素扰乱侵害和阻止更多有害微生物进入肠道的口服药物。这种药物会停留在胃肠道，降解任何抵达肠道的静脉注射抗生素，但不干扰其在身体其他部位的正常药效。在人体临床试验中，ribaxamase已证实降低了艰难梭状芽孢杆菌的感染。

Second Genome公司的首席商务官莫汉•莱尔（Mohan Lyer）表示，如同Synthetic Biologics公司，Second Genome公司也旨在将微生物基因组变成药物。比如，Second Genome公司将微生物与其功能进行比较，分别分析加重溃疡性结肠炎患者、控制型结肠炎患者和健康人的胃肠活检。通过基因组和转录组测序，研究人员确定了在健康和发炎的肠道中哪些微生物是存在的，哪些基因是表达的。从这个结果，研究人员可以得出结论：哪些由细菌组成的分子是会促进或阻挡炎症的。Second Genome公司正在研发一款平复炎症的药物，目前处于人体试验第一阶段。

“FishTaco”计算方法

像Second Genome，CosmosID和Diversigen这样的公司可以完成各项工作，从样本准备、测序到生物信息学分析，这使得科学家即使缺乏专业知识仍然能够探测微生物基因组。但是，那些拥有专业知识及兴趣的研究人员自主研发了新型的工具并与大家共享。

位于西雅图的华盛顿大学的计算生物学家阿尔哈南•伯伦斯坦（Elhanan Borenstein）表示，大部分的分析工具都会提出下列问题：“样本中有哪些微生物群？”或者“这个微生物群中有什么基因？”这两个问题就像两块拼图，而整合这两个数据库并不容易。这其中的问题在于：不同的分类群组在不同人的微生物群中发挥着相似的作用。伯伦斯坦的实验室最近提出了一个解决方案，被称为“功能转移分类学贡献者”的计算方法，简称FishTaco。

对初学者，FishTaco方法将调查微生物样本中的所有群组，根据已知的基因组推测宏基因组测序中的哪些基因与哪些微生物有关联。同时，当某个微生物的基因组不可获得时，这种方法也可以推测哪些基因组属于哪些种类。接着，这些信息便可以帮助科学家判断：哪些物种或种群对正在比较的宏基因组和微生物群之间的关键差异负责。例如，伯伦斯坦和他的同事对Ⅱ型糖尿病患者和健康人的肠道微生物排序数据进行了比较。宏基因组数据显示在糖尿病患者样本中有几种糖分传递基因过量，然而，是哪个细菌导致了过多的糖分摄入？FishTaco方法确定了欸西氏菌属对其中一个种类糖分的输送负责，而双歧杆菌的分子对另一种糖分的输送负责。

伯伦斯坦说：“这类信息可以帮助科学家通过重新平衡执行所需功能的物种，例如通过抗生素或益生菌治疗以改善健康。这将为个体化和专门干预手段打开大门。”

位于德克萨斯州休斯敦市的儿童微生物研究中心及贝勒医学院的微生物生态学家艾米莉•霍利斯特（Emily Hollister）表示，目前微生物科学家很少采用这种综合分析，尽管他们经常对哪个细菌在微生物群中发挥哪些功能做有根据的猜测。霍利斯特正将FishTaco方法运用到她自己关于肠道及呼吸道的微生物不平衡的研究当中。她说：“我们所发现的这些差异也许可以为潜在诊断或治疗的目标提供信息。”